RNAシーケンスにおける注目の応用分野

RNAシーケンシング（RNA-seq）は、次世代シーケンシング（NGS）技術の強力な応用であり、研究者に生命のセントラルドグマを別の視点から理解する手段を提供します。DNAシーケンシングはDNAベースの変異や遺伝子コードを詳細に調べることができますが、特定の時間にどの遺伝子が発現しているかについては推測することしかできません。それに対し、RNA-seqは遺伝子発現の時間的および空間的な動態を観察し、遺伝子調節の方法を明らかにし、時には病気のメカニズムに関する貴重な洞察を提供します。

過去10年間のNGS技術の進展により、急速かつ継続的な革新の時代が到来し、その技術の新しい応用が定期的に開発されています。RNA-seqも例外ではありません。近年では、シーケンシング技術へのアクセスの拡大により、広範な活用が可能になり、それに応じて、臨床、産業、学術の各分野にまたがる多様な応用が増えています。RNA-seq技術は、研究者が公衆衛生の脅威を特定し、細胞のアイデンティティの流動的な性質を探求し、癌を引き起こすキメラ同定の助けとなるなど、多くの応用例があります。

この読み物では、RNA-seqの現状を探り、その技術の概要と応用方法、そしてこの急速に改善されている技術の利点を享受するためのツールを紹介します。RNA-seqの応用の包括的なリストを提供することは教科書に値する作業ですが、代わりに、RNA-seqの利点の範囲を示し、今後数年間でこの技術がどのように重要になると考えられるかを示すいくつかの応用を選びました。

RNA-seqとは

前述の通り、RNA-seqはNGS技術を活用してRNA転写産物を仮説に依存せずに検出し、研究者がmRNA、マイクロRNA、長鎖非コードRNA、環状RNA、および他の無数のRNA種の発現をカタログ化できるようにします。DNAシーケンシングと同様に、RNA-seqの威力は、比較的シンプルでハイスループットかつ多重化されたワークフローを通じて膨大な遺伝データを生成する能力にあります。このようなデータは、細胞のプロファイリング、遺伝的バリエーションの影響の研究、病理学的プロセスの特定に使用できます。

DNAシーケンシングとは異なり、RNA-seqは遺伝子発現の動態を研究できます。転写後、RNA種はオルタナティブスプライシング、転写産物の融合、転写産物の分解などの幅広い修飾を受ける可能性があり、これらは最終的なタンパク質産物に大きな影響を与えますが、DNAシーケンシングデータからは簡単には予測できません。さらに、これらの修飾の程度は細胞の状況に影響されるため、動的な環境にある単一の細胞でも時間とともに異なるトランスクリプトームプロファイルを示すことがあります。

RNA-seqの注目の応用分野

悪性細胞の進化から廃水の解析に至るまで、RNA-seqの恩恵を受ける研究トピックのリストは毎年増加しているように見えます。以下は、RNA-seqの価値が多様な応用分野でどのように高まっているかを示すために選ばれた一部の例です。

公衆衛生のための環境RNAの検出

遺伝物質は常に細胞から放出され、体内の組織や環境に広がります。DNAに比べ、RNAは体外では短命です。水や土壌中のRNA分解酵素はこれらの一本鎖分子を迅速に分解し、短い断片にしてしまいます¹。しかし、保護タンパク質カプセルに包まれたRNAは、環境中で長期間生存することができます。感染した生物から咳やくしゃみ、またはトイレの排水とともに排出されるRNAウイルスがその例です。RNA-seqのおかげで、これらのウイルスRNAは公衆衛生の取り組みに役立つ指針となります^2-6。

COVID-19パンデミックの間、RNA-seqは廃水ベースの疫学調査でますます採用されるようになりました。この方法では、下水処理施設や排水から収集された廃水サンプルを使用して、ウイルス種の内容、拡散、および進化を人口レベルで監視します^2-5。このアプローチにより、公衆衛生当局は臨床現場で観察される前にウイルス感染や新しい変異株の発生を検出するだけでなく、無症状のウイルス拡散を特定することも可能です。この情報は、予防的な公衆衛生対策の配布と実施を導くのに役立ちます。

これを実現するために、研究者は複雑な溶液からRNAトランスクリプトを分離するのに役立つターゲットキャプチャパネルなど、多くのRNA-seqツールを利用します^7,8。Twistは、3,153種類のウイルスゲノムをキャプチャするための100万以上のユニークなプローブで構築された包括的なウイルス研究パネルなどの感染症パネルを開発し、ウイルス遺伝物質の分離とシーケンスを可能にしています。また、Twistは、ウイルス検査の品質管理を可能にする安全な合成RNAコントロールも開発しました。

同様の応用が廃水ベースの疫学調査における細菌病原体の検出にも次世代シーケンシングを使用して開発されています⁹。また、公衆衛生の応用にとどまらず、RNA-seqは環境サンプルに基づく生態系設定での大動物および鼻小動物の検出にも価値のあるツールとなりつつあります。これらの応用について詳しくは、こちらとこちらをご覧ください。

循環腫瘍RNA（ctRNA）による腫瘍検出

当然のことながら、RNA-seqは癌研究において重要なツールとなっており、腫瘍細胞の高解像度プロファイルを構築し、それらを特徴付けるプロセスを調べるためにしばしば使用されています。しかし、技術の活用が増えるに従い、癌研究における利用方法も多様化しています。遺伝子発現の違いをカタログ化するだけでなく、RNA-seqは現在、(1)局所的な腫瘍異質性を明らかにするため（空間トランスクリプトミクスによる）、(2)新規RNAトランスクリプトとその疾患における機能を発見する方法として（長鎖シーケンシングの進歩のおかげで）、および(3)循環腫瘍RNAの検出を通じて潜在的に非侵襲的な診断ツールとして使用されています。

セルフリー核酸は、がん研究および診断においてますます重要な情報源となっています。DNAとRNAの両方が血漿やその他の体液中を循環しており、それらは起源の細胞に関する貴重な情報を運んでいます。例えば、患者の血漿を治療後に収集し、循環腫瘍DNA（ctDNA）の存在を分析することで、腫瘍細胞の残存や再発を間接的に測定することができます（これを「微小残存病変検査」といいます）¹⁰。腫瘍生検や画像診断に比べ、細胞外核酸の測定ははるかに侵襲性の低い方法であり、長期的な連続モニタリングにも適しています。そのため、ctDNAシーケンシングを中心とした診断アッセイの開発が進められています。

同様に、セルフリーRNAのキャプチャとシーケンシングは、腫瘍の検出およびプロファイリングにおいて貴重なツールとなりつつあり、ctDNAよりもいくつかの潜在的な利点を提供しています。遺伝子の発現レベルに応じて、ctRNA転写産物は対応するctDNA断片よりも多く存在する可能性があり、より深いシーケンシングによってさらに高感度な診断マーカーの検出が可能になります。さらに、ctRNAの発現レベルの微妙な変化は、腫瘍の進化を時間とともに評価し、新たな治療抵抗性の発展を検出するために使用できます^11,12。特に注目すべきは、循環マイクロRNA（miRNA）の検出です。他の多くのRNA形式とは異なり、miRNAはセルフリー環境で非常に安定しています。これは主に、タンパク質複合体やエクソソームと結合しているためです（循環miRNAの約90％がタンパク質に結合しています）。セルフリーmiRNAの正確な機能は完全には理解されていませんが、シグナル伝達分子や細胞間遺伝子調節のツールとして機能する可能性があると考えられています。例えば、miRNA-21はがん細胞によって放出され、その後遠隔の細胞と相互作用し、最終的にテロメラーゼ活性の増加や化学療法耐性の誘発を引き起こす一連のイベントを引き起こすことが報告されています¹³。

新規トランスクリプトと疾患ドライバーの特定

現在のショートリードシーケンシングのワークフローには技術的な制限があり、多くの研究室では特定の遺伝子変異、特に構造変異をDNAおよびRNAの両方のレベルで検出することが困難です。しかし、これらの変異は人間の遺伝的ランドスケープに広く存在しています。一方、ロングリードシーケンシング技術は構造変異の検出に適しており、最近の進歩により、腫瘍トランスクリプトミクスの研究など、さまざまな応用での採用が拡大しています。

ロングリードRNAシーケンシングは、シーケンシングリードのマッピング時の推測を減らし、研究者がフェーズされた完全なトランスクリプトを自信を持って再構築できるようにします。これにより、異常なスプライシング、重複または失われたエクソン、キメラなどの複雑な分子を確実に検出および定量化することができます。ロングリードシーケンシングを用いた腫瘍トランスクリプトームの最近の探索研究では、スプライス変異から転写後および組み合わせ遺伝子融合イベントに至るまで、多くが新規である複雑かつ動的なトランスクリプト変異のランドスケープが明らかにされました^12,17-20。例えば、ロングリードRNA-seqを使用して乳がん細胞株（不死化および患者由来の両方）のトランスクリプトームを調べた最近の研究では、142,514のユニークな全長トランスクリプトアイソフォームが特定され、その約80％が新規であることがわかりました²²。

遺伝子融合が転写レベルで発生することは比較的新しい発見ですが、その支持証拠は増え続けています^22,23。これらの融合イベントがどのように発生し、それがどのような機能的結果をもたらすかについて、まだ多くを学ぶ必要があります。幸いなことに、ロングリードRNA-seqへのアクセスが拡大することで、今後10年間で人間のトランスクリプトミクスの変異に関する理解が大幅に拡大することが期待されます。

組織および細胞の不均一性を明らかにする

過去10年間で、マルチオミクス技術は急速に成長し、解像度、スループット、および測定される生物学的モダリティが増加する傾向があります。前のセクションで述べたように、DNAシーケンシングとRNA-seqは個々に強力な研究ツールですが、それぞれの生物学的材料にコード化された情報に焦点を絞りがちであり、多くの場合、バルク細胞集団で行われます。このような狭い焦点は、DNA、RNA、タンパク質、および細胞環境の本質的に連携し相互に関連する性質を無視しており、これらの要因の協力が細胞間の不均一性をもたらす方法を無視しています。そのため、生命の中心的な教義全体のパターンを関連付けることを意図して、単一細胞の多モーダルデータを収集するための大規模な取り組みが近年行われてきました。

この目的のために、シングルセルRNA-seqは基礎技術として証明されており、多くのマルチオミクスプロジェクトの基礎を形成しています。マイクロ流体法またはプレートベースの方法を通じて、個々の細胞を分離し、RNA-seqを行うことで、個々の細胞間の遺伝子発現パターンに関する情報が提供されます。これにより、各細胞の増殖状態、活性化状態、および代謝活動について詳細な推論を構築することができます。このような情報は、腫瘍の不均一性の程度を詳細に説明する際、細胞の分化および成熟プロセスを注釈する際、または大規模なCRISPRスクリーンにおける遺伝子摂動の影響を研究する際に価値があります。

シングルセルRNA-seqは、ヒトの誘導多能性幹細胞（iPSC）から派生した細胞を扱う際の品質管理ツールとしても非常に有用であることが証明されています。ヒトのiPSCは、in vitroでの疾患モデル作成および薬剤開発のための成熟したヒト細胞株の有望な供給源ですが、iPSCの分化は多くの場合、確率的なプロセスであり、高度に不均一な細胞集団を生成します。Fernandesらによる最近の分析では、シングルセルRNA-seqにより、一般的なiPSC分化プロトコル（指向性分化に基づく）を使用して誘導されたドーパミン作動性ニューロンの一見均一なグループの中に不均一性が明らかにされました。多くの細胞がドーパミン作動性マーカーを持っていたにもかかわらず、トランスクリプトーム解析は4つの異なるニューロンサブタイプと2つのニューロン前駆細胞集団が存在することを示しました²⁴。このような不均一性は生物学的ノイズを引き起こし、その後の研究の再現性を低下させる可能性があります²⁵。この例は、シングルセルRNA-seqがiPSC分化方法の特性評価においてだけでなく、細胞間不均一性を明確にするためのより広範な使用においても貴重なツールであることを示しています。

シングルセルRNA-seqの強みを活かし、多くの研究者がトランスクリプトミクスプロファイルをゲノム、エピゲノム、プロテオーム、および空間状況データのパターンと関連付けることを目的としたマルチオミクスプラットフォームを開発しました。特定のマルチオミクス技術に関する情報については、最近の包括的なレビューをいくつか参照することをお勧めします^26,27。

マルチオミクス技術の応用は多岐にわたりますが、その大部分は同じ基本的な理論を共有しています。異なる補完的なデータセットを解析することで、マルチオミクス研究は細胞タイプの詳細な分類や細胞プロセスの高解像度観察を可能にします。

例えば、マルチオミクスデータセットは、細胞系譜の追跡や臨床的に関連するサブポピュレーションの特定を促進しています。2019年の研究では、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、メチロームシーケンスを組み合わせて、慢性リンパ性白血病細胞の特定のサブポピュレーションを特定し、そのメチル化およびトランスクリプトミクスプロファイルが治療感受性を予測することが示されました。他の応用には、発達段階の異なる臓器特有の細胞タイプのカタログ化、空間分解能を伴う腫瘍不均一性のプロファイリング、環境要因と悪性表現型との相関を可能にすること、そしてゲノム要素の体系的な注釈付け（その他多くの応用）が含まれます²⁷。

マルチオミクス技術の継続的な発展と公共のマルチオミクスデータセットの増加は、今後10年間でこの技術の分子科学全体での採用がますます増えることを示唆しています。

タンパク質コーディング遺伝子の定義の拡大

2003年にヒトゲノムドラフトが公開された後、多くの研究者はヒトゲノムが20,000から25,000のタンパク質しかコードしていないことに驚きました。これらの分析では、関連するタンパク質コーディング遺伝子と見なされるものについていくつかの基本的な仮定が行われました。具体的には、遺伝子は300ヌクレオチド（>100アミノ酸）を超える配列であり、開始コドンと停止コドンに挟まれ、他のオープンリーディングフレーム（ORF）と重ならないものと定義されました^29-31。

それから20年以上が経過した今、これらの厳格な定義が多くのコーディング配列を見逃していた可能性があることがわかっています。その産物は今ようやく明らかになりつつあります。

過去10年間で、リボソームシーケンス（ribo-seq）は、非コードトランスクリプトの中から新しいタンパク質コーディング配列を発見するためにますます使用されるようになりました。そして、これらのタンパク質の少なくとも一部は、細胞の挙動や表現型の決定に機能的に関与しているようです。ショウジョウバエの研究では、生理学的発展に関与する複数のマイクロプロテイン（32アミノ酸未満の長さ）が発見されました。哺乳類細胞では、DNA修復、ミトコンドリア機能、およびRNA調節（その他の役割も含む）に重要な役割を持つマイクロプロテインのレパートリーが増加しています。

マイクロプロテインが機能的に活性であるかどうかに関係なく、細胞に重要な影響を及ぼす可能性があります。細胞は未使用のペプチドを消化するためにリソースを消費する必要があります。通常のタンパク質と同様に、マイクロプロテインも変異して病理学的な凝集体を形成したり、特異な抗原となることがあります。マイクロプロテインについてはまだ多くのことがわかっていませんが、過去数年間でこれらの見過ごされがちな存在とその細胞生物学、病理学、および薬剤開発における潜在的な価値に対する認識が高まってきました。RNA-seqは、マイクロプロテインの研究と発見において今後も基礎技術であり続けるでしょう。

氷山の一角

前述のセクションで述べたように、RNA-seqは公衆衛生から新しいタンパク質の発見まで、幅広い目的で使用されています。この読み物では、その表面しか取り上げておらず、重要で興味深いRNA-seqの応用を省略せざるを得ませんでした。しかしながら、この読み物全体で参照したいくつかの詳細なレビューや記事は、これらのトピックおよびその他についての強力な出発点となるでしょう。また、Twistが提供するRNA-seqツールについてさらに学びたい場合は、こちらをご覧ください。

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