エピジェネティクス研究の解像度を向上させるメチル化シーケンスの効率改善ツール

Twist NGS メチル化検出システムは、従来のバイサルファイトシーケンシング手法に比べて多くの利点を提供します。

Twist Bioscienceは最近、New England Biolabs（NEB®）と提携し、ゲノムメチル化パターンの検出を改善するためのエンドツーエンドのメチル化シーケンシング（methyl-seq）ワークフローを開発しました。この読み物では、エピジェネティクス研究においてこのパイプラインがメチル化塩基コールの信頼性向上につながる方法について詳しく解説します。

最も研究されているエピジェネティック修飾の1つであるDNAメチル化は、DNAメチルトランスフェラーゼがシトシン-ホスホグアニン（CpG）ジヌクレオチドのシトシン残基にメチル基を付加する際に起こります。この修飾は、ゲノムの不安定性や転写抑制を促進することで、細胞分化などの正常なプロセスから発がんのような異常なプロセスまで、さまざまな生物学的プロセスに寄与します。

腫瘍学者たちは診断用バイオマーカーの候補を数多く検討してきましたが、DNAメチル化ほど有望なものはほとんどありません。まず、異常なDNAメチル化はがんの進行過程の非常に早期に発生します。また、DNAメチル化はゲノム全体で不均一なパターンを示すため、複数の部位をアッセイすることで、より特異的で感度の高い検査が可能になります。このため、特に液体生検を用いた循環腫瘍DNA（ctDNA）の検査のように非侵襲的に行える場合、DNAメチル化の検出は早期がんスクリーニングに魅力的なアプローチとなります。

メチル化をシーケンシングで検出することには多くの課題が伴います。メチルシーケンス手法は、十分な量のサンプルDNAがないと、全ゲノムに適用するのが難しい場合があります。また、メチル化検出のために変換されたライブラリは、ターゲットエンリッチメントによるコスト削減を複雑にするため、キャプチャが困難です。以下では、新しいTwistのメチルシーケンスワークフローがこれらの課題を克服し、既存のメチルシーケンスワークフローに対するコスト効率が高く、かつ非常に効率的な代替手段を提供する方法について説明します。

従来、バイサルファイトシーケンシングはDNAメチル化検出のゴールドスタンダードとされてきました。この技術では、バイサルファイト塩を使用して、メチル化されていないシトシンを化学的にウラシルに変換します。続くPCR増幅によって、このウラシルがチミンに置き換えられます。その後、得られたライブラリを次世代シーケンシング（NGS）でシーケンスする際、元々メチル化されていなかったシトシンはチミンとして、メチル化されたシトシンはシトシンとしてシーケンスされます。

Methyl-seqでは、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換された後、チミンに変換されます。

バイサルファイトシーケンシングは、ハイスループットで1塩基対レベルの解像度を持つ定量的な読み取りを提供しますが、バイサルファイト処理によってDNAサンプルが大幅に劣化する可能性があります。特にメチル化されていないシトシンは劣化しやすいため、バイサルファイト変換によりGC含量の高い領域のカバレッジが低下することがあります。サンプルの劣化はアッセイの感度を低下させ、ctDNAのように濃度が低いサンプルへの適用が困難になることがあります。

NEBは最近、従来のバイサルファイト変換プロセスに代わる酵素的手法を開発しました。この新しいメチルシーケンスライブラリ調製方法は、EM-seq™（エンザイマティックメチルシーケンス）と呼ばれ、酵素を使ってDNAサンプルをメチル化検出用に変換します。バイサルファイト変換ライブラリと比較すると、酵素的に調製されたライブラリは、さまざまなGC含量にわたってより均一なカバレッジを示します。これにより、EM-seqの検出率はバイサルファイト変換に比べて15％高くなります。

ターゲット領域のシーケンシングカバレッジについて、バイサルファイトおよび酵素変換されたライブラリーを使用しました。酵素変換では、バイサルファイト変換よりも均一なGCカバレッジが得られます。

多くのNGSアッセイと同様、ターゲットエンリッチメントによって全体のコストやシーケンシングの負担を軽減することができます。このステップは、メチル化シーケンシングのワークフローにおいて、サンプルDNAの量に応じて変換の前または後で行うことが可能です。サンプルDNAが豊富に得られる研究用途では、変換の前にターゲットゲノムをエンリッチメントすることも可能です。このやり方であれば未変換のDNA配列だけを考慮すれば良いため、パネル設計における問題は少なくなります。

変換の後でターゲットエンリッチメントを行うことで、より高感度なアプリケーションが可能となりますが、いくつかの注意点があります。変換により、新たにユニークなDNA配列が生成され、パネル設計で考慮する必要が出てきます。また、変換により多くのシトシンがチミンに変換されるため、DNA配列が単純化され、その結果、これらの配列のキャプチャがより困難になることがあります。多くのターゲットメチルシーケンス実験では、高いオフターゲット率が発生しがちです。

Twistは、プレキャプチャ変換の課題を克服するために、カスタムパネル設計の専門知識と大規模並列合成プラットフォームを活用しました。その結果生まれたのが、Twist Custom Methylationパネルです。これらのパネルはメチル化検出に最適化されており、メチル化、非メチル化、センス、アンチセンスの4つの潜在的な配列すべてをキャプチャするためのプローブを含んでいます。また、異なる厳密度を選択して、実験ごとにキャプチャ性能を最適化することも可能です。TwistのDNA合成プラットフォームに基づいて構築されるため、Twist Custom Methylationパネルは、Twist Customパネルと同じ高い精度、均一性、および柔軟性を提供します。

さらに、Twistは市販のメチル化キャプチャパネルであるTwist Human Methylomeパネルを開発しました。この慎重に設計されたパネルは、320万以上のCpGサイトをカバーし、ヒトゲノム内のCpGアイランドの84%および数百万の追加の生物学的に重要なメチル化部位をエンリッチメントすることが可能です。TwistのNGSメチル化検出システムと組み合わせることで、このパネルは非常に均一で正確かつ広範なメチル化シーケンシングデータが得られます。

EM-seqとTwist Custom Methylationパネル（カスタムまたは既製品と）の組み合わせは、あらゆるメチル化レベルに対応するターゲットメチルシーケンスのエンドツーエンドソリューションを提供します。このオールインワンのソリューションを完成させるのが、Twist Custom Methylationパネルと組み合わせて使用することでオフターゲットキャプチャを最小限に抑えるメチルシーケンス専用のハイブリダイゼーションブロッカーであるMethylation Enhancerです。これら全体のソリューションを、Twist NGS Methylation Detection Systemと名付けています。