読み物：CRISPR 第1部ーCRISPRの簡単な歴史
CRISPRは、いまや最先端のゲノム編集技術です。手短に概要を知りたいですか？ここではその歴史を簡単にご紹介します。
合成生物学に関心がある方や、これから初めてゲノム編集に挑戦しようと考えている方なら、CRISPRという名前を耳にしたことがあるはずです。CRISPRは現世代を代表する高度なゲノム編集技術であり、現在ではPubMedに2,500本以上の関連論文が掲載され、この3年間で採用率は爆発的に増加しています。初心者から経験豊富な研究者まで、Twist BioscienceはCRISPRの発展に重要な役割を果たした6本の論文を通じて、その歴史を振り返ることができます。
Prokaryotic genomes contain well-organized repeats
科学者たちは以前から、多くの細菌や古細菌のゲノムに、50bp未満のはっきりと整然と並んだ繰り返しモチーフが存在することに気づいていました。
規則性があるということは機能があるはずですが、その機能は謎に包まれていました。まず、それらは非コード領域であり、さらにこのパターンは異なる種に繰り返し現れる一方で、それぞれの種ごとに独自の反復配列を持ち、しばしば同じパターンを持つ他の種とは大きく異なっていたのです。
この機能の謎を解明しようとする試みは、上記の論文によって始まりました。その論文では、これらの反復領域を「Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR、規則的に間隔を置いて並んだ短い回文反復配列）」と名付け、さらにそれらの繰り返しの近くに存在する複数のCRISPR関連遺伝子（Casファミリーと命名）を記録しました。ここにCRISPR-Casパラダイムが誕生したのです。
Sequences in between these repeats are surprisingly foreign
CRISPRの間には、やはり50塩基未満の不規則な配列が挟まれていました。CRISPR遺伝子座は次のような構造をしています：CRISPR-ランダム配列-CRISPR-ランダム配列-CRISPR-ランダム配列…
Mojicaらは、細菌と古細菌の両方を代表する67株から4,500のCRISPR配列をシーケンスし、それらをGenBank内のデータベースと比較しました。
その結果は驚くべきものでした。これらの配列は、バクテリオファージ（細菌に感染するウイルス）の配列、侵入性プラスミド（細菌が他の細菌を破壊するために使う“武器”）の配列、そしてCRISPRのスペーサー領域に取り込まれた自己ゲノム配列と一致していたのです。
Eukaryotes are not the only organisms to have an adaptive immune system
前の論文の著者たちは、温泉で生育する古細菌 Sulfolobus solfataricus が、SIRVと呼ばれるウイルスに自然免疫を持っていることに気づきました。また、そのCRISPRスペーサーの中にSIRVのDNAが含まれていたのです。これは注目すべき点であり、ウイルスが宿主に感染するための「武器」としてDNAを利用していることを考えると、CRISPRがウイルス攻撃に対する細菌の獲得免疫の一種である可能性が仮説として立てられました。
さらにBarrangouらは、細菌をウイルス攻撃にさらし続けて耐性を獲得させると、その攻撃ウイルスのDNAがCRISPRのスペーサー領域に導入されることを示しました。偽陽性を除外するために、耐性株からウイルスDNAを含むスペーサーを削除し、再びウイルス攻撃にさらしたところ、耐性は即座に失われました。
Cas uses CRISPR to become a guided missile
Garneau et al., 2010 and Deltcheva et al., 2011
CRISPRとスペーサーDNAがウイルスに対する免疫を提供することから、科学者たちは、ある遺伝要素が別の遺伝要素を破壊する正確な仕組みを探り始めました。両方の重要な論文は、CRISPR/CasがCRISPRスペーサー内の情報を「座標」として利用し、侵入してきたDNA配列を切断することを示しています。
耐性株のCRISPR/Casに挑戦したウイルスDNAは、常にスペーサーと一致する配列内で切断されました。この切断は、CRISPR配列の認識モチーフから一定の距離で必ず起こり、この距離はその種ごとに一貫していました（プロトスペーサー隣接モチーフ、PAM）。
ウイルス耐性を持つ細菌は、CRISPR/Casシステム内の2つの異なる領域から大量のRNAを産生します。ひとつはCRISPRスペーサー自体（crRNA）であり、もうひとつはCRISPRリピートのすぐ外側で、Cas遺伝子の近くに位置する領域（tracrRNA）です。これら2種類のRNA断片がそろって、エンドヌクレアーゼタンパク質Cas9とともにウイルスDNAを切断するために必要であることが分かりました。
If Cas9 is CRISPR RNA guided, and we can engineer DNA sequences…
この注目すべき研究は、過去5年間で最大の生物学的進歩の有力候補といえるでしょう。それはまるでワンツーパンチのノックアウトのような成果であり、合成生物学だけでなく、遺伝子工学、個別化医療、農学、遺伝学、細胞生物学など、数多くの分野を革命的に前進させました。
Jinekらは、crRNAとtracrRNAが相補的な配列であるため二本鎖を形成し、この二本鎖がCas9をPAMに隣接する侵入DNAの相補鎖へと導くことを示しました。二種類のDNA切断ドメインを持つCas9はDNAをほどいて二本鎖に分け、侵入DNAに鈍端の切れ目を入れます。
さらに著者らは、crRNAとtracrRNAをつなげて「ガイドRNA（gRNA）」と名付けた新しい分子を作成することで、システムを簡素化できることを示しました。任意のgRNA配列を合成すれば、Cas9による鈍端切断を任意のDNA配列で実現できます。これにより、研究者は生物のゲノム上の任意の場所を正確に切断でき、目的の遺伝子を導入またはノックアウトすることが比較的容易に可能となったのです。
現状（The status quo）
CRISPR研究はこの4年間で爆発的に拡大し、指数関数的な成長を遂げてきました。2015年の終わり頃には、この分野で1日に5本の論文が発表されるほどでした。2016年1月だけでも、200本以上の新しい論文がPubMedの学術データベースに登録されています。私たちは、この驚異的な技術がこれからの1年でどこへ導いてくれるのか、とても楽しみにしています。
