読み物：専門家との会話 ハイスループットCRISPRスクリーニングのためのsgRNAライブラリーのデザイン
以下は、TwistがGenetic Engineering Newsのために作成したE-book「変化するCRISPRスクリーニングの現状：最新のCRISPRスクリーニング手法と技術のガイドブック」からの抜粋です。E-bookの全文はここからダウンロードできます。
経験豊富な研究者にとっても、sgRNAライブラリを設計することは非常に困難な作業です。何千ものガイドそれぞれについて、ターゲット遺伝子への正確性を確保するために慎重な検討が必要です。しかし、正確性が必ずしも有効性を意味するわけではありません。CRISPRによる突然変異の約20％はフレーム内変異を引き起こし、その多くはタンパク質機能に影響を与えない可能性が高いのです1。CRISPRが哺乳類細胞の遺伝子編集に適用されてから10年が経過し、その間にsgRNAライブラリ設計のガイドラインは新しい知見や技術に応じて進化を続けてきました。この進化に伴い、効率を最大化しながらCRISPRスクリーニングの発見力を最大限に活用できるカスタムCRISPR sgRNAライブラリの需要も増加しています。
ここでは、TwistのCRISPR専門家2人に、sgRNAライブラリ設計の基本と、カスタムアプローチを検討している方へのアドバイスについてお話を伺います。ジュリアン・ジュード博士は著名なCRISPRの専門家で、sgRNA設計をスコアリングするためのVienna Bioactivity CRISPR（VBC）アルゴリズムの共同著者です1。ジュリアンはこの10年近く、研究者がCRISPRスクリーニングを向上させる手助けをしてきました。彼とともに登場するのは、Twist Bioscienceの最高技術責任者であるシーユアン・チェン博士です。
研究者はどこからsgRNAライブラリの設計を始めるべきでしょうか？
シーユアン: 最適なsgRNAライブラリを設計するには、実験のスクリーニング目標が影響します。たとえば、CRISPRiスクリーニングに適したsgRNAは、従来のノックアウトスクリーニングに適したsgRNAとは異なり、デリバリー方法に合わせたバックボーンに挿入されるべきです。そのため、まずは一般的なルールを基盤にしつつ、最終的には自分の特定のニーズに合わせることが重要です。
ジュリアン: おっしゃる通り、優れたsgRNAライブラリは特定のニーズに応じて慎重に設計されていますが、考慮すべき一般的な指針もあります。sgRNA設計の基本ルールを学ぶための優れたリソースがいくつもあります。簡単に言えば、sgRNAはターゲット外のDNA配列との相補性を最小限に抑え、GC含量が40％から80％の範囲にあり、スペーサーRNA部分が約17から24ヌクレオチドの長さ（使用するCasタンパク質により最適長が異なります）であるべきです。
適切なCRISPR関連タンパク質（Cas）を選択することも重要なステップです。ゲノムスクリーニング用に多様なタイプのヌクレアーゼが開発されており、ターゲット遺伝子付近の利用可能なPAM配列と、Casタンパク質に求める変化タイプを考慮することで最適なものを選ぶことができます。具体的な指針が必要なら、さまざまなCasタンパク質とその機能、PAM配列について概説されているジョン・ドーンチの2019年のCRISPR技術に関するレビューを参考にするのも良いでしょう。
最新の優れたsgRNA設計ツールにはどのようなものがありますか？
ジュリアン: ノックアウトスクリーニングを行う場合、オンターゲットノックアウトや、少なくとも機能喪失のインフレーム変異を達成する可能性を高めるためのsgRNAの最適化方法があります。
最近、オーストリアのウィーンバイオセンターの研究チームと共に、Vienna Bioactivity CRISPRスコア（VBC）を開発しました。これは、高パフォーマンスなsgRNA予測ツールで、哺乳類細胞で信頼性の高い機能喪失アリルを
生成するsgRNAを選択する際に役立ちます1。このツールの開発では、機能喪失変異を引き起こす可能性が高いsgRNAの特性を評価しました。特に、保存度の高いアミノ酸の連続領域（7アミノ酸、21塩基対）をターゲットにするsgRNAが、より良い結果をもたらすことがわかりました。また、タンパク質のコアの疎水性ドメインに対応するDNA配列をターゲットにするsgRNAも良好なパフォーマンスを発揮することが判明しました。
ボックス1：CRISPR sgRNA設計における一般的な考慮事項
- GC含量は40％から80％の範囲に設定し、sgRNAとターゲットDNA間の強固な結合を確保します。
- ヘアピンやポリメラーゼ終結配列のような二次構造がsgRNA設計内で制限されるようにします。これらの構造はクローン効率やガイドの転写に影響を及ぼす可能性があります。
- ウイルスによる導入を行う場合、パッケージングに影響するポリA部位を除去します。
- ミスマッチを最小限にし、特にPAMの上流10塩基以内でのミスマッチを避けます。ミスマッチはスペーサー配列の後半部分では許容されますが、PAM近くでのミスマッチは結合や編集に影響を及ぼします。
- 使用するCasタンパク質に合わせて、sgRNAのスペーサー配列の長さを調整します。不一致があると編集効率が著しく低下します。
- 目的に合った最適なCasタンパク質を選択します。Casタンパク質は、認識するPAM配列や切断の種類など、編集性能に影響する複数の要因で異なります。
- sgRNAプロモーターが他のプロモーター、特に抗生物質耐性遺伝子の転写によく使用されるEF-1aプロモーターと重ならないようにします。重なるとsgRNAの転写効率が低下することがあります。
これらの考慮事項は、哺乳類細胞に焦点を当てた最近のいくつかの研究1-7に基づいており、他のシステムには当てはまらない場合があります。
私たちの研究で強調され、VBCスコアに反映されているのは、sgRNAライブラリが単にsgRNAの特異性だけでなく、遺伝子やタンパク質の構造に基づいてガイドを選択するとノックアウト達成率が高まるということです。[sgRNAに関する一般的な考慮事項については、ボックス1および2を参照してください。]
シーユアン: CRISPRi、CRISPRa、CRISPRon、CRISPRoffを用いて遺伝子発現を調整する実験では、選択可能なsgRNAの数が制限されます。例えば、CRISPRi sgRNAは転写開始部位直下の75塩基対内の配列を標的とすることで最も効果的であることが示されています。CRISPRoffの場合は、この範囲が広がり、転写開始部位の上流または下流500塩基対以内の配列を標的とするsgRNAが転写抑制に最も効果的とされています3。
ジュリアン: また、シングルセルCRISPRスクリーニングでは、ノックアウトまたはエピジェネティックな変動手法を使用できるため、各sgRNAが変動とその後のトランスクリプトームプロファイルに正確にリンクされるようにライブラリを設計する必要があります。シングルセルCRISPRスクリーニングは、機能的なsgRNAがポリアデニル化できないため課題があり、多くのRNAシーケンシング法はポリアデニル化された転写産物の捕捉に依存しています。
この問題を克服するために、プラスミド選択遺伝子の下流にある3’長末端反復領域にバーコードを挿入する方法が開発されています。この方法は有効ですが、クローン化過程でのテンプレートスイッチングによりバーコードがsgRNAから分離する可能性があり、プラスミドの約50％に影響を与えることが複数の研究で示唆されています4-6。
したがって、バックボーン内のsgRNA挿入位置やシーケンシングでの検出方法を考慮することが非常に重要です。CROP-seqやPeturb-seqなどの手法は代替アプローチを提供しています。[シングルセルCRISPRスクリーニング技術の最新情報についてはE-Bookの第7章を参照してください。] sgRNA設計に役立つツールも多く、先述のVBCスコアも含めたツールが便利なGitHubリポジトリに集められています。
ボックス2：状況に応じた考慮事項
遺伝子ノックアウト用sgRNA設計の考慮点
- 保存されているアミノ酸配列（理想的には7アミノ酸の長さ）をターゲットにします。これらの配列はタンパク質機能に重要であるため保存されている可能性が高く、この領域の破壊は効果的であることが多いです。
- タンパク質のコアにある疎水性ドメインをターゲットにします。コアの疎水性ドメインを編集するとタンパク質機能が損なわれやすい理由は不明ですが、実験的には効果的な標的方法であることが示されています。
- 選択的スプライシングを避けるために、大きなエクソンをターゲットにします。これにより、編集が成功しても遺伝子ノックアウトが回避されることを防ぎます。
- タンパク質コーディング配列の末端近くをターゲットにしないようにします。わずかな短縮にもかかわらず、いくつかのタンパク質は依然として発現し機能する可能性があるためです。
- 代替開始部位近くの領域を避けます。代替スプライシング部位と同様、代替開始部位が標準的な転写産物の欠損を補う可能性があります。
- 多型が頻繁に存在する部位を避けます。sgRNAがターゲット配列に完全一致して設計されていても、配列の多型により予期しないミスマッチが生じ、編集効率が低下する可能性があります。
- sgRNAプロモーターが、選択抗性遺伝子の転写にしばしば使用されるEF-1aプロモーターなどの他のプロモーターと重ならないようにします。重なるとsgRNAの転写効率が低下することがあります。
CRISPRi/a/on/off sgRNA設計の考慮点
- 限られたsgRNAオプションがあり、転写開始部位（TSS）やCpGアイランドを標的にする必要があります。
- CRISPRi sgRNAでは、TSSの+25から+75ヌクレオチド下流が理想的なターゲット領域であり、この範囲で遺伝子発現の最適な抑制が示されています。
- CRISPRaでは、TSSの上流150–75ヌクレオチドが最適な活性化を提供します。
- CRISPRoffおよびCRISPRon sgRNAは、転写開始部位を中心とした1kbのウィンドウに標的を合わせることで最も効果的です。この領域でのメチル化により、重要な転写因子の結合やポリメラーゼのリクルートが阻害されやすくなります。
これらの考察は、哺乳類細胞に焦点を当てた最近のいくつかの研究1-7から得られたもので、他のシステムには当てはまらない場合があります。
既成のCRISPR sgRNAライブラリが多数ありますが、研究者はこれらを使用するべきでしょうか、それともカスタム設計のライブラリを検討するべきでしょうか？
シーユアン: sgRNAライブラリの設計に不安がある、またはCRISPRスクリーニングに最適なバックボーンの選択に迷っている研究者には2つの選択肢があります。一般的なスクリーニングには既成のライブラリを使用するか、カスタムsgRNAライブラリの設計支援を受けることです。
前者は、予算が限られており、他の研究者によって既に検証されたライブラリを使用したい場合に適しています。既成ライブラリは通常、即時使用できるため、作成や展開の待機時間がほとんどありません。しかし、既成ライブラリにはいくつかの重要な欠点があります。CRISPR分野は急速に進化しており、固定されたsgRNAライブラリは使用時には時代遅れとなっている可能性があります。また、既成ライブラリは研究者の特定のニーズに合わせて調整することが難しく、広範な研究目的に対応するよう設計されているため、関心のある領域に対してカバレッジが過不足する可能性もあります。
カスタムsgRNAライブラリには多くの利点があります。カスタムライブラリの本質は柔軟性にあり、特に最近のCRISPR技術を用いるスクリーニングには非常に役立ちます。
ジュリアン: その良い例がプライムエディティングです。プライムエディティングは大規模スクリーニングにおいて精密な変動を加える可能性を秘めていますが、それには非常に長いsgRNA配列のライブラリが必要です。プライムエディティングsgRNA（pegRNA）は、sgRNAだけでなく、プライマーバインディング部位と修復テンプレートをコードする30ヌクレオチド以上の配列も含むため、通常のsgRNAよりも長くなります8。このため、pegRNAライブラリは長いオリゴヌクレオチド合成を使用して正確に構築する必要があり、これを上手に行える企業は限られていますが、Twist Bioscienceはその一つです。
カスタムライブラリでは、プラスミドバックボーンやtracrRNA、バーコードの配置など、スクリーニングの改善に役立つ機能を自由に調整できますが、既成ライブラリではこれらの要素が固定されています。
既成ライブラリとカスタムソリューションを組み合わせて利用する研究者も増えています。
広範囲のスクリーニングでは、何百から何千もの遺伝子変動が確認され、さらなる追跡が必要になることがあります。そのための最も効率的な方法の一つが、プライマリの全ゲノムスクリーニングで特定されたすべての遺伝子をターゲットにしたカスタムガイドライブラリを用いた二次的な集中的スクリーニングです。研究者は、カスタムsgRNAライブラリと既成ライブラリの両方をうまく利用でき、スケジュール、リソース、ニーズによって選択が異なります。いずれのライブラリを選んでも、均一でエラー率が低いものを選ぶことが重要です。
❝支援を求めることを恐れず、創造的でいましょう❞
均一でエラー率の低いCRISPR sgRNAライブラリはどこで手に入りますか？
シーユアン: Twist Bioscienceです。Twistのシリコンベースのオリゴヌクレオチド合成プラットフォームは、低エラーで非常に均一なオリゴヌクレオチドを迅速に生成でき、それをsgRNAライブラリに変換できます。均一性と低エラー率はCRISPRスクリーニング実験にとって非常に魅力的です。
ジュリアン: そうですね、均一性は非常に重要です。均一性とは、ライブラリ内で各ガイドが他のガイドと比べてどれだけ均等に含まれているかを指します。均一性が高いライブラリでは、各ガイドが等しく表現されるのに対し、均一性が低いライブラリでは特定のガイドが過剰に含まれる可能性があります。スクリーニングでは、均一性が低いと、少数派のガイドの効果が見えにくくなる可能性があり、スクリーニング感度の低下や結果の偏りが生じることがあります。
均一性を補うためには、少数派のガイドの効果を検出するために大量の細胞が必要です。そのため、均一なライブラリは、細胞数が限られるプライマリセルラインでのスクリーニング成功を少ない細胞で実現できます。したがって、sgRNAライブラリを設計する際には、均一性の高いオリゴプールを提供するベンダーを選ぶことが非常に重要です。この均一性の重要性については、当社のホワイトペーパーでさらに詳しく述べています。
典型的な23,000本の90merオリゴが含まれるオリゴプールのNGS品質管理データでは、300倍のリードカバレッジでプールの均一性が確認されています。この表には、このプールの均一性メトリクスが示されています。Twistのオリゴはバイアスがなく、均一性が高く、完全なオリゴの再現性があります。
シーユアン: エラー率も同様に重要です。CRISPRシステムはsgRNAのスペーサー部分に基づいて正確にDNA配列をターゲットにするよう設計されています。sgRNAの後半10ヌクレオチドにおけるミスマッチはある程度許容されますが、ミスマッチはオフターゲット効果の可能性を高めます。そのため、sgRNA生成中のエラーは特異性に影響を与える可能性があります。また、プライムエディティングのような修復テンプレートを使用するアプリケーションでは、テンプレートがエラーなしでコードされていることが非常に重要です。
Twist Bioscienceのオリゴプールを使用することで、研究者はカスタムライブラリを設計し、選択したベクターにクローン化することが可能です。TwistのCRISPR専門家が、ライブラリ設計やベクター、NGS戦略についてのアドバイスも提供できます。
sgRNA設計の最終的な考慮事項はありますか？
ジュリアン: sgRNA設計においてしばしば見落とされる点として、プライマーバインディングサイトのコンタミネーションから実験を保護する必要性が挙げられます。
NGSでのsgRNAのシーケンシングは、スクリーニングの最後にどのsgRNAが存在するかを評価するための迅速で簡単な方法です。このプロセスでは、スクリーン内のsgRNAのみを増幅できるユニークなプライマーバインディングサイトが非常に重要です。CRISPRを頻繁に使用するラボでは、プライマーバインディングサイトのコンタミネーションが容易に発生する可能性があります。プラスミドからの増幅はゲノムDNAからの増幅よりも簡単であるため、NGSのリードの大部分がコンタミネートしたベクター由来になる可能性が高いです。
この種のコンタミネーションはさまざまな理由で発生する可能性があります。通常、ラボではsgRNA転写を促進するU6プロモーター内のプライマーバインディングサイトが使用されます。例えば、スクリーニングの前にセルラインでノックアウトを行いたい場合、同じCRISPRプラスミド構築体（U6プロモーターを含む）を再利用してしまい、誤ってプライマーバインディングサイトを挿入してしまうことが簡単に起こり得ます。
実験を保護するためには、スクリーニングライブラリに特有のプライマーバインディングサイトを追加することが重要です。その方法の一つとして、スクリーニングライブラリプラスミドにユニークなプライマーバインディングサイトを挿入することが挙げられます。
見落とされがちな問題：プライマーバインディングサイトのコンタミネーション
スクリーニングに挑戦する研究者への最後のアドバイスはありますか？
シーユアン: 支援を求めることを恐れず、創造的でいましょう。多くの人が既存の手法をそのまま踏襲しがちですが、実験を向上させる創造的なスクリーニング方法は数多く存在します。そして、Twist Bioscienceのような場所には常に専門家がいてサポートを提供しています。ご質問があれば、twistbioscience.com/contactまでお気軽にお問い合わせください。
この抜粋が掲載されているE-book全文を読むと、最新のCRISPRスクリーニング手法と技術についてさらに学ぶことができます。
参考文献
- Michlits, Georg, et al. “Multilayered VBC Score Predicts SgRNAs That Efficiently Generate Loss-of-Function Alleles.” Nature Methods, vol. 17, no. 7, 8 June 2020, pp. 708–716, 10.1038/s41592-020-0850-8.
- Doench, John G. “Am I Ready for CRISPR? A User’s Guide to Genetic Screens.” Nature Reviews Genetics, vol. 19, no. 2, 4 Dec. 2017, pp. 67–80, 10.1038/nrg.2017.97.
- Nuñez, James K., et al. “Genome-Wide Programmable Transcriptional Memory by CRISPR-Based Epigenome Editing.” Cell, vol. 0, no.0, 9 Apr. 2021, www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)00353-6, 10.1016/j.cell.2021.03.025.
- Datlinger, Paul, et al. “Pooled CRISPR Screening with Single-Cell Transcriptome Readout.” Nature Methods, vol. 14, no. 3, 18 Jan. 2017, pp. 297–301, 10.1038/nmeth.4177.
- Hill, Andrew J., et al. “On the Design of CRISPR-Based Single Cell Molecular Screens.” 29 Jan. 2018, 10.1101/254334.
- Xie, Shiqi, et al. “Frequent SgRNA-Barcode Recombination in SingleCell Perturbation Assays.” PLOS ONE, vol. 13, no. 6, 6 June 2018, p.e0198635, 10.1371/journal.pone.0198635.
- Mohr, Stephanie E., et al. “CRISPR Guide RNA Design for Research Applications.” The FEBS Journal, vol. 283, no. 17, 22 June 2016, pp. 3232–3238, www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5014588/, 10.1111/febs.13777.
- Anzalone, Andrew V et al. “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.” Nature vol. 576,7785 (2019): 149-157. doi:10.1038/s41586-019-1711-4
